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流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选ckit+肝癌细胞的比

【摘要】  目的 比较流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选肝癌亚群细胞的效果。方法 原代培养肝细胞癌细胞,分别以流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板结合分离法分选ckit+肝癌细胞,然后使用流式细胞仪鉴定细胞纯度,计算回收率;以台盼蓝检测细胞活力,CCK8法检测细胞增殖能力,裸鼠移植测其成瘤率,并进行统计学分析。结果 流式细胞仪分选所得到的ckit+肝癌细胞纯度、回收率最高,与其他两种方法分选所得细胞的相应指标比较,差异有统计学意义(P<0.05);3种方法所得细胞之间的细胞活力、刺激指数、移植成瘤率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞仪分选前后的细胞之间活力、刺激指数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 流式细胞仪分离法是分离肝癌亚群细胞的较佳方法。

【关键词】  流式细胞仪; 免疫磁珠; 亲和板结合分离法

【Abstract】  Objective  To compare the effect of three methods including flow cytometry sorting, magnetic cell sorting and immune panning isolation in isolating sub-population in hepatoma carcinoma cells. Methods  ckitpositive cells in primarily cultured human hepatoma carcinoma cells were separated with flow cytometry sorting, magnetic cell sorting and immune panning isolation, respectively. The purity, viabililty, cell proliferation and the ratio of tumorigenesis after transplantation of the hepatoma carcinoma cells were determined with flow cytometry, trypan blue exclusion, CCK8 assay and allogeneic graft to nude mouse respectively. Then, the data were compared statistically.Results  The purity and recovery rate of the ckitpositive cells isolated with flow cytometry sorting were significantly higher than those with the other two methods, with statistical difference (P<0.05). There was no significant difference upon viablilty, stimulation index and tumorigenesis after transplantation among the cells isolated with the three methods (P>0.05). There was no significant difference upon viability and proliferation between the cells before and after separating by flow cytometry sorting (P>0.05). Conclusions  Flow cytometry sorting is an effective and practical method for isolating subpopulation in hepatoma carcinoma cells.

【Key words】  Flow cytometry;  Magnetic cell sorting;  Immune panning isolation

肿瘤干细胞研究需要获取高纯度、高活力、高增殖能力的肿瘤亚群细胞,并尽量避免混杂细胞、低活力、低增殖能力细胞对细胞亚群特性的干扰。笔者在前期研究的基础上[1],比较了流式细胞仪分选(flow cytometry sorting,FCMS)、免疫磁珠分选(magnetic cell sorting,MACS)及亲和板结合分离法(immune panning isolation) 3种方法分选ckit+肝癌细胞的效果,以期找到一种分离肝癌亚群细胞的较佳方法,为肿瘤干细胞的研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  标本:取材于南方医科大学附属珠江医院2006年4月经手术切除的肝癌标本,经病理证实为原发性肝细胞癌。患者术前未进行任何抗肿瘤治疗,手术后患者4周内存活。

1.1.2  实验动物:裸小鼠(BALB/c)75只,雌雄兼用,3~5周龄,质量10~20 g,由南方医科大学动物实验中心提供。

1.1.3  主要试剂:低糖、胰蛋白酶、无钙镁离子的平衡盐溶液(DHank‘S液,pH7.2~7.4)、细胞增殖试剂CCK8购自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公司;兔抗人ckit多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG(1∶200)购自丹麦Santa Cruz公司;抗兔IgG1免疫磁珠购自德国Miltenyi Biotech公司;其他常用试剂为国产分析纯。

1.1.4  主要仪器:免疫磁珠分选磁力架、MS磁性分离柱购自德国Miltenyi Biotec公司;Epics Altra型流式细胞仪购自美国Beckman Coulter公司;各种常用耗材购自广州威佳科技公司。

1.2  方法

1.2.1  分离、培养肝癌细胞:参考文献[1-2]方法,分离、纯化肝癌细胞,常规培养及传代。

1.2.2  ckit+肝癌细胞的分选:对数生长期的第8次传代细胞的单细胞悬液,分别以下述3种方法分选ckit+细胞:(1)流式细胞仪分选:按流式细胞仪分选的要求,以兔抗人ckit多克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,标记细胞后上机分选,获取ckit-细胞和ckit+细胞。(2)免疫磁珠分选:参考文献[3]方法,以兔抗人ckit多克隆抗体和抗兔IgG1免疫磁珠,严格按照免疫磁珠分选操作规则获取ckit-细胞和ckit+细胞。(3)亲和板结合分离法分选肿瘤细胞:按文献[2]中亲和板结合分离法,以兔抗人ckit多克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,分选ckit-细胞和ckit+细胞。每种方法分选出5组细胞,进行如下检测。

(1)细胞活力检测:采用台盼蓝排斥实验检测细胞活力并计算细胞存活率=[活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)]×100%。

(2)细胞增殖能力试验:参照文献[4]的CCK8法检测并计算细胞刺激指数(stimulate Index,SI),SI=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)。

(3)ckit+肝癌细胞的纯度:按流式细胞仪检测的要求,以兔抗人ckit多克隆抗体为一抗,FITC标记的羊抗兔IgG为二抗,各组细胞标记后上机检测ckit+肝癌细胞的纯度。计算分选前、后ckit+细胞的百分比。

(4)计算细胞回收率:计算分选前后的细胞数,求出3种方法分选后的得率。

(5)ckit+亚群肝癌细胞成瘤能力测定:参考文献[1-2]方法,每个样本接种5只裸鼠,检测3周内生成移植肿瘤的比例。

1.3  统计学分析

所有数据采用SPSS 11.5软件分析。多组比较采用OneWay ANOVA检验及LSD两两比较,两组之间比较采用独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  流式细胞仪、免疫磁珠及亲和板分离法分选后ckit+肝癌细胞的纯度、回收率、活力、增殖能力、移植瘤成瘤率对比分析

表1显示:3种分选方法分选后的ckit+肝癌细胞活力、增殖能力和成瘤率差异无统计学意义(P>0.05),而纯度、回收率差异有统计学意义(P<0.05)。进一步两两比较显示:3种分选方法分选后的ckit+肝癌细胞的纯度之间差异均有统计学意义(P<0.05)。纯度从高到低依次为流式细胞仪分选,免疫磁珠分选,亲和板结合分选。亲和板结合法分选ckit+肝癌细胞的回收率低于其他2种分选方法(P<0.05),而流式细胞仪分选与免疫磁珠分选2种方法分选ckit+肝癌细胞的回收率差异无统计学意义(P>0.05)。表1  3种方法分别分选后的ckit+肝癌细胞的纯度、回收率、活力、增殖、移植瘤成瘤率的比较 注:F、P分别为3种分选方法之间各指标行OneWay ANOVA检验的F值和P值;a:P<0.05,与流式细胞仪分选比较;b:P<0.05,与免疫磁珠分选比较

2.2  流式细胞仪分选前后细胞悬液中细胞的活力、增殖能力对比分析表2显示:流式细胞仪分选前后细胞悬液中细胞的活力、 增殖能力之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。 表2  流式细胞仪分选前后细胞悬液中细胞的 活力、增殖能力的比较

3  讨论

在肿瘤干细胞的研究中,需要按照一定的细胞表面标志抗原将肿瘤细胞分成不同的细胞亚群,再比较各细胞亚群异种移植瘤的成瘤率。为避免混杂细胞对结果的干扰,需要尽可能提高分选后目的细胞的纯度,且不应过多影响分选后细胞的活力、增殖能力和成瘤能力。同时,由于肿瘤干细胞在肿瘤细胞中所占比例较低,也要求分选后细胞的回收率不应过低。因此,寻找一种分选效率高且不影响分选后细胞的活力、增殖能力和成瘤能力的分选方法对肿瘤干细胞的研究非常重要。

在各种分选方法中,流式细胞仪分选、免疫磁珠分选和亲和板结合分离法分选较为常用。这3种方法在实际应用中各有优缺点:(1)流式细胞仪分选虽纯度较高、回收率高,操作环境全封闭,污染机会较免疫磁珠分选小,但设备昂贵,技术复杂,需专业技术人员操作,操作费时,适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。(2)免疫磁珠分选无需昂贵的大型仪器,设备相对便宜,方法简便易行,但分离效率较流式细胞仪分选略低,且耗材相对较贵,适合无大型流式细胞仪设备且对分选细胞纯度要求不高的分选。(3)亲和板结合分离法分选成本较低,简便易行,无菌环境好,无需特殊设备,对细胞活力及增殖能力基本无影响,但细胞纯度和回收率较低,适合对细胞纯度、回收率要求较低的分选[1,5-6]。

上述方法在实际研究应用中需根据具体要求进行选择。本文将这3种方法应用于肝癌细胞ckit+细胞的分选中,比较其回收率、分选后细胞的纯度、活力、增殖能力和成瘤能力。本研究发现,亲和板结合分离法的回收率和分选后的细胞纯度最低;流式细胞仪分选所得的细胞活力、增殖能力和成瘤能力与其他2种分选方法所得细胞的相应指标比较,差异无统计学意义,其回收率高于亲和板结合分离法的回收率,与免疫磁珠分选法的回收率差异无统计学意义;而在分选所得细胞的纯度方面,流式细胞仪分选明显高于其他2种分选方法。

综上所述,流式细胞仪分选应用于低含量细胞的分选时,其回收率较高,分选后的细胞纯度最高,且细胞活力、增殖能力和成瘤能力与其他2种分选方法所得细胞的相应指标比较,差异无统计学意义。这说明流式细胞仪分选在保证较高分选效率的同时,未影响分选后细胞的生物学特性,适用于肿瘤干细胞研究对分选方法的要求。

另外,通过实践,我们认为在流式细胞仪分选中应注意以下几点:(1)选用活力好的细胞进行分选,提高分选效果。(2)各项操作时间尽量缩短,动作轻柔。(3)离心细胞时,速度与时间不宜过快和过长,避免对细胞的损害。(4)接收分选后细胞的培养基中血清含量可适当提高,所得细胞尽快用于进一步移植实验或继续培养。(5)注意操作间的无菌环境和无菌操作。

【参考文献】

[1] 颜政,方驰华.人肝细胞癌细胞亚群的克隆分离及异质性机制的初步研究.世界华人消化杂志,2006,14(5):481-485.

[2] 颜政,方驰华,高鹏.人原发肝细胞癌干细胞表面标志的初步研究.南方医科大学学报,2006,26(9):1304-1306.

[3] 舒赛男,魏来,方峰.免疫磁珠分选系统在分离大鼠骨髓干细胞群中的应用.标记免疫分析与临床,2006,13(1):35-37.

[4] 唐古生,蔡建明,倪瑾,等.反义STAT3寡核苷酸对B16细胞辐射敏感性的研究.中华放射医学与防护杂志,2006,26(4):324-327.

[5] Snow C. Flow cytometer electronics. Cytometry A,2004,57(2):63-69.

[6] Siegel D L. Selecting antibodies to cellsurface antigens using magnetic sorting techniques. Methods Mol Biol,2002,178:219-226.
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